Пульмонология и фтизиатрия

Противовирусная активность энисамиума в отношении вирусов гриппа в дифференцированных нормальных клетках эпителия бронхов человека

Энисамиум йодид как современный высокоэффективный препарат лечения гриппа. Результаты проведенного исследования энисамиума.

Д. Больц1, С. Пен1, М. Муззио1, П. Даш2, П. Томас2, Р. Мехта1, В. Маргитич3, 1НИИ Иллинойского технологического института, Чикаго, Иллинойс, США !, 2Детский исследовательский госпиталь имени святого Иуды, Мемфис, Теннесси, США, 3ПАО «Фармак», Киев, Украина

Экскурс в проблему

Грипп — это острое респираторное заболевание, вы­зываемое вирусами гриппа А и В, которые приводят к раз­витию ежегодных эпидемий с высоким уровнем заболе­ваемости и смертности, а иногда и пандемий. Хотя вакци­ны для профилактики гриппа доказали свою эффектив­ность в уменьшении выраженности симптомов заболева­ния во время эпидемий гриппа, однако в связи с возмож­ным антигенным несоответствием вакцины и относитель­но продолжительным процессом разработки клинически доступной вакцины против нового штамма вируса созда­ние эффективных противовирусных препаратов для угне­тения инфекционного процесса при гриппе является акту­альной задачей. На данный момент только один класс про­тивовирусных препаратов (ингибиторы нейраминидазы, такие как осельтамивир и занамивир) рекомендован для использования с целью профилактики и лечения гриппа у взрослых и детей во всем мире.

Сегодня значительные усилия сосредоточены на раз­работке новых способов лечения и выборе мишеней для действия лекарственных средств, которые дали бы воз­можность устранить патогенные свойства вируса гриппа. В этом контексте привлекают внимание некоторые препа­раты, которые на данный момент находятся на рынке стран СНГ и обнаруживают противовирусную активность в отношении вирусов гриппа А и В. Одним из таких препа­ратов является энисамиум йодид (рис. 1), который за­регистрирован и маркетируется под торговым названием Амизон® в России, Украи­не, Белоруссии, Казахста­не и Узбекистане как про­тивовирусное средство против гриппа.

Химическая структура энисамиума йодида

Клинические исследо­вания, проведенные в Рос­сии, продемонстрировали высокую эффективность препарата против вирусов гриппа А и В, что позволи­ло говорить о энисамиуме как о перспективном сред­стве, предназначенном для лечения гриппа. Однако имею­щихся экспериментальных данных об эффективности этой производной изоникотиновой кислоты как противовирус­ного агента, действенного в отношении гриппа, недоста­точно. Поэтому целью данного исследования было оценить ожидаемую противовирусную активность энисамиума в от­ношении вирусов гриппа in vitro. Пилотные исследования на MDCK- и A549-клетках продемонстрировали низкую проницаемость энисамиума — на уровне 0,08 и 0,87% соот­ветственно, а также отсутствие противовирусного эффек­та. Поглощение энисамиума дифференцированными нор­мальными бронхоэпителиальными клетками человека (nor­mal human bronchial epithelial — NHBE) было лучшим в сравнении с клетками A549 и MDCK и варьировало в пре­делах 1,7-2,1%. Поэтому именно культуры клеток NHBE были избраны для оценки эффективности и наличия проти­вовирусного эффекта энисамиума в отношении вирусов гриппа.

Материалы и методы

Культура клеток: в исследовании были использова­ны дифференцированные клетки NHBE EpiAirway System компании «MatTek» (Ашланд, Массачусетс, США). Клетки от одного донора были использованы для анализа одно­родности. Апикальную поверхность клеток подвергали влиянию влажного 95% воздуха / 5% CO2, а также меняли среду и отмывали муцин каждые 24-48 ч.

Исследуемые материалы: исследованный про­дукт — энисамиум (Амизон®) был предоставлен ПАО «Фар­мак». Препарат для положительного контроля — осельтамивира карбоксилат, полученный от Toronto Research Chemicals, TRC (Торонто, Канада).

Вирусный агент: в NHBE-клетки были инокулированы вирусы гриппа А через апикальную поверхность. После инкубации в течение 1 ч вирусный инокулят удаля­ли из клеток, апикальную поверхность клеток промывали натрий-фосфатным буферным раствором (Phosphate Buffered Saline — PBS).

Введение исследуемого материала: для проведе­ния положительного контроля (использование осельтамивира карбоксилата) культура клеток NHBE инкубировалась с базальной стороны с осельтамивиром в течение 60 мин до заражения вирусом. Энисамиум или контроль добавлялся к базальному компартменту культуры клеток до или после инокуляции и инкубировался в течение определенного условиями эксперимента периода.

Результаты

Дифференцированные NHBE-клетки были инфицирова­ны вирусом гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) с показателя­ми множественности инфекции (multiplicity of infection MOI), равными 0,01 PFU/клетку (A) (PFU — plaque-forming unit, бляшкообразующая единица — отдельная инфекционная ви­русная доля в суспензии вирусов, которую обнаруживают по образованию бляшки), 0,001 PFU/клетку (B) и 0,0001 PFU/клетку (C). Энисамиум (1000; 500; 100; 50 и 10 μM) до­бавляли к базальному компартменту через 1 ч после иноку­ляции вируса (табл. 1, 2).

Противовирусная активность энисамиума

Смывы с апикальной поверхности клеток собирали через 24 ч (черные кружки) и 48 ч (черные квадраты) после заражения и титровали с помощью TCID50-анализа (рис. 2). Межевое значение, которое опре­деляли в ходе анализа, составило 0,75 log10TCID50/мл.

Ингибиторная активность энисамиума

Неинфицированные NHBE-клетки обрабатывали 1000 μM энисамиума, затем клетки отбирали через 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 и 24 ч после контакта с исследуемым веще­ством. Представлены концентрации энисамиума в клет­ках (рис. 3).

Кинетика внутриклеточного поглощения энисамиума

Дифференцированные NHBE-клетки были инфици­рованы вирусом гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) в ко­личестве MOI=1,0 PFU/клетку и экспонировались с энисамиумом 2000 μM. Энисамиум добавляли в базальный компартмент через -1, 0, 2, 4, 6, 8 и 10 ч после инокуля­ции вируса и оставляли в течение 24 ч. Время инокуляции вируса указывается как 0 ч. Супернатанты собирали че­рез 24 ч после заражения с верхнего отсека и титровали при помощи TCID50-анализа (A). Экспрессия матричного гена (Matrix gene — M gene) связана с контролем уровня вируса, экспрессия гена была нормирована по уровню мРНК β-актина в соответствующем образце (B) (рис. 4).

Эффективность ингибирования репликации вируса гриппа

Дифференцированные NHBE-клетки были предвари­тельно обработаны энисамиумом 1000, 500, 100 μM за 24 ч до инокуляции. Через 24 ч к NHBE-клеткам был инокулирован вирус гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) в ко­личестве MOI=0,001 PFU/клетку; энисамиум находился в культуральной среде с базальной стороны в течение все­го эксперимента. Осельтамивира карбоксилат (1 μM) был добавлен к базальному компартменту за 1 ч до инокуля­ции вируса, он находился там в течение всего экспери­мента. Время инокуляции вируса указывается как 0 ч. Супернатанты собирали через 24 ч (черные столбики) и 48 ч (белые столбики) после инфицирования (рис. 5).

Эффект предварительной инкубации NHBE-клеток

Заключение

  •   Энисамиум дозозависимо снижает репликацию всех исследуемых вирусов гриппа, в т. ч. сезонного H1N1, который имел мутацию H275Y NA, и таким образом обна­руживает эффективность против осельтамивир-резистентного вируса.
  •   Противовирусная эффективность энисамиума яв­ляется дозозависимой, а эффект лучше выражен при бо­лее низких инфекционных дозах.
  •   Максимальная эффективность энисамиума обна­ружена при его добавлении в течение 8 ч после зараже­ния.
  •   Внутриклеточная концентрация энисамиума, до­стигаемая при его добавлении в количестве 1000 μM во время инфицирования, коррелирует с противовирусной эффективностью энисамиума.

Выявлена противовирусная активность противогрип­позного соединения — энисамиума, которая подтвержда­ет данные о его клинической эффективности. Хотя моле­кулярный механизм действия энисамиума до сих пор до конца не идентифицирован, данные, представленные вы­ше, указывают на то, что препарат влияет на вирусную репликацию вирусов гриппа. В случае, когда энисамиум добавляли перед или вскоре после инфицирования, сни­жение экспрессии матричного гена и вирусных титров указывает на то, что он ингибирует синтез вирусной РНК. Интересно, что вирусные титры продолжали повышаться в присутствии энисамиума. Поэтому можно сделать вы­вод, что препарат угнетает репликацию вируса гриппа, но не блокирует ее полностью. Необходимы дальнейшие ис­следования для обеспечения лучшего понимания меха­низма действия энисамиума.

Благодарность. Данная работа финансировалась ПАО «Фармак». Мы выражаем глубокую благодарность доктору Дж. Морри (John Morrey), Д. Сми (Donald Smee) и Е. Говорковой (Elena A. Govorkova) за ценные советы и полезные обсуждения в ходе этих исследований.

Комментировать

Нажмите для комментария

Здравствуйте,
Выйти