Противовирусная активность энисамиума в отношении вирусов гриппа в дифференцированных нормальных клетках эпителия бронхов человека

Энисамиум йодид как современный высокоэффективный препарат лечения гриппа. Результаты проведенного исследования энисамиума.

Д. Больц¹, С. Пен¹, М. Муззио¹, П. Даш², П. Томас², Р. Мехта¹, В. Маргитич^{3, 1}НИИ Иллинойского технологического института, Чикаго, Иллинойс, США ^{!, 2}Детский исследовательский госпиталь имени святого Иуды, Мемфис, Теннесси, США, ³ПАО «Фармак», Киев, Украина

Экскурс в проблему

Грипп — это острое респираторное заболевание, вы­зываемое вирусами гриппа А и В, которые приводят к раз­витию ежегодных эпидемий с высоким уровнем заболе­ваемости и смертности, а иногда и пандемий. Хотя вакци­ны для профилактики гриппа доказали свою эффектив­ность в уменьшении выраженности симптомов заболева­ния во время эпидемий гриппа, однако в связи с возмож­ным антигенным несоответствием вакцины и относитель­но продолжительным процессом разработки клинически доступной вакцины против нового штамма вируса созда­ние эффективных противовирусных препаратов для угне­тения инфекционного процесса при гриппе является акту­альной задачей. На данный момент только один класс про­тивовирусных препаратов (ингибиторы нейраминидазы, такие как осельтамивир и занамивир) рекомендован для использования с целью профилактики и лечения гриппа у взрослых и детей во всем мире.

Сегодня значительные усилия сосредоточены на раз­работке новых способов лечения и выборе мишеней для действия лекарственных средств, которые дали бы воз­можность устранить патогенные свойства вируса гриппа. В этом контексте привлекают внимание некоторые препа­раты, которые на данный момент находятся на рынке стран СНГ и обнаруживают противовирусную активность в отношении вирусов гриппа А и В. Одним из таких препа­ратов является энисамиум йодид (рис. 1), который за­регистрирован и маркетируется под торговым названием Амизон^® в России, Украи­не, Белоруссии, Казахста­не и Узбекистане как про­тивовирусное средство против гриппа.

Клинические исследо­вания, проведенные в Рос­сии, продемонстрировали высокую эффективность препарата против вирусов гриппа А и В, что позволи­ло говорить о энисамиуме как о перспективном сред­стве, предназначенном для лечения гриппа. Однако имею­щихся экспериментальных данных об эффективности этой производной изоникотиновой кислоты как противовирус­ного агента, действенного в отношении гриппа, недоста­точно. Поэтому целью данного исследования было оценить ожидаемую противовирусную активность энисамиума в от­ношении вирусов гриппа in vitro. Пилотные исследования на MDCK- и A549-клетках продемонстрировали низкую проницаемость энисамиума — на уровне 0,08 и 0,87% соот­ветственно, а также отсутствие противовирусного эффек­та. Поглощение энисамиума дифференцированными нор­мальными бронхоэпителиальными клетками человека (nor­mal human bronchial epithelial — NHBE) было лучшим в сравнении с клетками A549 и MDCK и варьировало в пре­делах 1,7-2,1%. Поэтому именно культуры клеток NHBE были избраны для оценки эффективности и наличия проти­вовирусного эффекта энисамиума в отношении вирусов гриппа.

Материалы и методы

Культура клеток: в исследовании были использова­ны дифференцированные клетки NHBE EpiAirway System компании «MatTek» (Ашланд, Массачусетс, США). Клетки от одного донора были использованы для анализа одно­родности. Апикальную поверхность клеток подвергали влиянию влажного 95% воздуха / 5% CO₂, а также меняли среду и отмывали муцин каждые 24-48 ч.

Исследуемые материалы: исследованный про­дукт — энисамиум (Амизон^®) был предоставлен ПАО «Фар­мак». Препарат для положительного контроля — осельтамивира карбоксилат, полученный от Toronto Research Chemicals, TRC (Торонто, Канада).

Вирусный агент: в NHBE-клетки были инокулированы вирусы гриппа А через апикальную поверхность. После инкубации в течение 1 ч вирусный инокулят удаля­ли из клеток, апикальную поверхность клеток промывали натрий-фосфатным буферным раствором (Phosphate Buffered Saline — PBS).

Введение исследуемого материала: для проведе­ния положительного контроля (использование осельтамивира карбоксилата) культура клеток NHBE инкубировалась с базальной стороны с осельтамивиром в течение 60 мин до заражения вирусом. Энисамиум или контроль добавлялся к базальному компартменту культуры клеток до или после инокуляции и инкубировался в течение определенного условиями эксперимента периода.

Результаты

Дифференцированные NHBE-клетки были инфицирова­ны вирусом гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) с показателя­ми множественности инфекции (multiplicity of infection MOI), равными 0,01 PFU/клетку (A) (PFU — plaque-forming unit, бляшкообразующая единица — отдельная инфекционная ви­русная доля в суспензии вирусов, которую обнаруживают по образованию бляшки), 0,001 PFU/клетку (B) и 0,0001 PFU/клетку (C). Энисамиум (1000; 500; 100; 50 и 10 μM) до­бавляли к базальному компартменту через 1 ч после иноку­ляции вируса (табл. 1, 2).

Смывы с апикальной поверхности клеток собирали через 24 ч (черные кружки) и 48 ч (черные квадраты) после заражения и титровали с помощью TCID50-анализа (рис. 2). Межевое значение, которое опре­деляли в ходе анализа, составило 0,75 log₁₀TCID₅₀/мл.

Неинфицированные NHBE-клетки обрабатывали 1000 μM энисамиума, затем клетки отбирали через 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 и 24 ч после контакта с исследуемым веще­ством. Представлены концентрации энисамиума в клет­ках (рис. 3).

Дифференцированные NHBE-клетки были инфици­рованы вирусом гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) в ко­личестве MOI=1,0 PFU/клетку и экспонировались с энисамиумом 2000 μM. Энисамиум добавляли в базальный компартмент через -1, 0, 2, 4, 6, 8 и 10 ч после инокуля­ции вируса и оставляли в течение 24 ч. Время инокуляции вируса указывается как 0 ч. Супернатанты собирали че­рез 24 ч после заражения с верхнего отсека и титровали при помощи TCID50-анализа (A). Экспрессия матричного гена (Matrix gene — M gene) связана с контролем уровня вируса, экспрессия гена была нормирована по уровню мРНК β-актина в соответствующем образце (B) (рис. 4).

Дифференцированные NHBE-клетки были предвари­тельно обработаны энисамиумом 1000, 500, 100 μM за 24 ч до инокуляции. Через 24 ч к NHBE-клеткам был инокулирован вирус гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) в ко­личестве MOI=0,001 PFU/клетку; энисамиум находился в культуральной среде с базальной стороны в течение все­го эксперимента. Осельтамивира карбоксилат (1 μM) был добавлен к базальному компартменту за 1 ч до инокуля­ции вируса, он находился там в течение всего экспери­мента. Время инокуляции вируса указывается как 0 ч. Супернатанты собирали через 24 ч (черные столбики) и 48 ч (белые столбики) после инфицирования (рис. 5).

Заключение

•   Энисамиум дозозависимо снижает репликацию всех исследуемых вирусов гриппа, в т. ч. сезонного H1N1, который имел мутацию H275Y NA, и таким образом обна­руживает эффективность против осельтамивир-резистентного вируса.
•   Противовирусная эффективность энисамиума яв­ляется дозозависимой, а эффект лучше выражен при бо­лее низких инфекционных дозах.
•   Максимальная эффективность энисамиума обна­ружена при его добавлении в течение 8 ч после зараже­ния.
•   Внутриклеточная концентрация энисамиума, до­стигаемая при его добавлении в количестве 1000 μM во время инфицирования, коррелирует с противовирусной эффективностью энисамиума.

Выявлена противовирусная активность противогрип­позного соединения — энисамиума, которая подтвержда­ет данные о его клинической эффективности. Хотя моле­кулярный механизм действия энисамиума до сих пор до конца не идентифицирован, данные, представленные вы­ше, указывают на то, что препарат влияет на вирусную репликацию вирусов гриппа. В случае, когда энисамиум добавляли перед или вскоре после инфицирования, сни­жение экспрессии матричного гена и вирусных титров указывает на то, что он ингибирует синтез вирусной РНК. Интересно, что вирусные титры продолжали повышаться в присутствии энисамиума. Поэтому можно сделать вы­вод, что препарат угнетает репликацию вируса гриппа, но не блокирует ее полностью. Необходимы дальнейшие ис­следования для обеспечения лучшего понимания меха­низма действия энисамиума.

Благодарность. Данная работа финансировалась ПАО «Фармак». Мы выражаем глубокую благодарность доктору Дж. Морри (John Morrey), Д. Сми (Donald Smee) и Е. Говорковой (Elena A. Govorkova) за ценные советы и полезные обсуждения в ходе этих исследований.