Неинвазивная диагностика синдрома системного воспалительного ответа и полиорганной дисфункции у недоношенных новорожденных

Комплексное клиническое и лабораторное обследование 68 доношенных и недоношенных детей с определением уровня растворимого рецептора фактора некроза опухоли-αр55 в моче: данные исследования.

Устинович Ю.А., ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования», Минск, Крастелева И.М., ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования», Минск, Котлинская Ю.В., ГУ «Республиканский научнопрактический центр гематологии и трансфузиологии», Минск

Резюме. Проведено комплексное клиническое и лабораторное обследование 68 доношенных и недоношенных детей с определением уровня растворимого рецептора фактора некроза опухоли-αр55 в моче. Установлено, что повышенный уровень р55 в моче недоношенных детей сопровождается более выраженными проявлениями мультисистемной дисфункции. Такие дети нуждаются в более длительной интенсивной терапии.

Введение

Синдром полиорганной дисфункции можно охарактеризовать как одновременное наличие дисфункции двух или более органов сердечнососудистой системы, центральной нервной системы, дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта, почек, печени, а также гематологические нарушения. В педиатрической практике он отмечается значительно чаще, чем у взрослых пациентов. По данным P. Cengiz (2006), его диагностируют у 11–27% пациентов педиатрических отделений интенсивной терапии и реанимации.

Первоначально синдром полиорганной дисфункции расценивали как результат непосредственного прямого поражения конкретного(-ых) органа(-ов), позже механизмы его развития стали описывать в контексте синдрома системного воспалительного ответа (ССВО). С учетом этой позиции в процессе выздоровления от полиорганной дисфункции должен восстановиться баланс между ССВО и компенсаторным противовоспалительным ответом. При этом, как правило, присутствует вторичная инфекция вследствие иммунной недостаточности, сопровождающей патофизиологический комплекс.

Предлагалось много гипотез патофизиологии развития синдрома полиорганной дисфункции. Критическая важность указанного феномена впервые отражена в работах Р. Вирхова. Его классическая триада тканевого повреждения включала гипоперфузию, гиперкоагуляцию и активацию эндотелиальных клеток. В настоящее время наиболее состоятельными считают гипотезы, основанные на наличии феномена порочного круга: ишемияреперфузия — воспаление.

Множество базовых витальных функций обеспечивается не отдельными органами, а в процессе взаимодействия большого количества различных структур организма посредством межклеточного взаимодействия, нейрогуморальных механизмов. С учетом этого оправданным видится использование термина «мультисистемная дисфункция» как более полно отражающего сущность происходящих событий.

Клинические проявления мультисистемной дисфункции у новорожденных аналогичны манифестации сепсиса. Однако сепсис далеко не всегда сопровождает полиорганную дисфункцию, и, тем более, выступает ее пусковым моментом. По данным J.D. Wilkinson и соавторов (1987), более чем у половины детей синдром полиорганной дисфункции развивается без наличия сепсиса. Как уже отмечено, ССВО сопровождает феномен ишемии-реперфузии, вызванный совершенно различными причинами. Среди них — острая асфиксия, острая дыхательная недостаточность (например респираторный дистресс-синдром), внутрижелудочковые кровоизлияния, острая почечная недостаточность. Описываемые гипотезы патофизиологии ССВО в принципе не противоречат друг другу, а скорее дополняют, расшифровывают происходящие процессы.

Диагностические критерии ССВО, сепсиса, септического шока (приведены ниже) приняты в 1992 г. (American College of Chest Physicians, Society of Critical Care Medicine Consensus Conference, 1992; Bone R.C. et al., 1992).

ССВО у детей характеризуется наличием как минимум двух из следующих критериев:

• Ректальная температура >38 °С (оральная — 37,8 °С, аксиллярная — 37,2 °С) или ректальная температура
• Частота сердечных сокращений >90 перцентиль соответственно возрасту.

• Тахипноэ с частотой дыхания >90 перцентиль соответственно возрасту или гипервентиляция с уровнем парциального давления углекислого газа в артериальной крови
• Количество лейкоцитов >12⋅109/л или <4⋅109/л, или >10% незрелых форм.

Сепсис — это ССВО, вызванный документированной или сильно подозреваемой инфекцией (выделенная при поступлении культура бактерий, вирусов или грибов и/или клиническая манифестация инфекции).

Тяжелый сепсис характеризуется наличием сепсиса плюс не менее одного из следующих критериев:

• Угнетение сознания (оценка по шкале комы Глазго
• Уровень лактата в артериальной крови >1,6 ммоль/л или в венозной крови >2,2 ммоль/л.
• Диурез

Септический шок определяется наличием гипотензии (двукратным измерением артериального давления) <3-й перцентили соответственно возрасту после назначения 20 мл/кг массы тела или более кристаллоидов или коллоидов, плюс:

• Необходимость в инотропной или вазопрессорной поддержке (допамин или добутамин ≥5 мкг/кг/мин) или
• Любой из приведенных критериев тяжелого сепсиса.

Эти критерии с некоторыми вариациями используются в практике до настоящего времени (Dellinger R.P. et al., 2004). Следует отметить, что они имеют ограниченную ценность в отношении новорожденных, особенно недоношенных. Такие характеристики ССВО, как гипо-и гипертермия в неонатальной практике чаще всего являются следствием дефектов ухода за новорожденным в силу анатомо-физиологических особенностей его терморегуляции. Показатели белой крови также подвержены сильным возрастным вариациям. Предпринимается большое количество попыток модифицировать даже не столько эти критерии, сколько концептуальное понимание проблемы ССВО, основываясь на оценке провоспалительных и противовоспалительных медиаторов, вовлеченных в ССВО (Silveira R.C., Procianoy R.S., 1999).

Особенности иммунной системы плода и новорожденного накладывают отпечаток на течение и проявления воспалительного ответа. Упоминавшаяся низкая пиретическая реакция в период новорожденности, призванная отражать повышенную метаболическую активность, связана с высвобождением активированными лейкоцитами эндогенных пирогенов — интерлейкина (ИЛ)-1, фактора некроза опухоли (ФНО)-α и др. Механизмы увеличения термогенеза при воздействии этих цитокинов на гипоталамус развиты слабо. Лейкоцитоз и нейтрофиллез, обычно сопровождающие бактериальные инфекции, информативны у взрослых и детей старшего возраста, но имеют ограниченную ценность в период новорожденности. При септических состояниях у новорожденных чаще отмечают нейтропению. Поэтому поиск информативных маркеров воспалительной реакции в неонатальный период активно продолжается.

С-реактивный белок (СРБ) — белок острой фазы воспаления, широко использующийся с конца 80-х годов ХХ в. для диагностики септического процесса у новорожденных. СРБ синтезируется печенью в ответ на воспалительную реакцию и как ее составная часть. Главным индуктором синтеза СРБ является ИЛ-6, действующий вместе с ИЛ-1 и ФНО-α. СРБ синтезируется в течение 6–8 ч от начала инфекционного процесса или повреждения ткани, пик достигается к 24–48 ч, затем его концентрация падает. Среди недостатков теста следует отметить, что уровень СРБ возрастает достаточно медленно в первые 12–24 ч инфекционного процесса, что снижает чувствительность теста. Кроме того, рост СРБ отмечают и при неинфекционных состояниях, например при внутрижелудочковых кровоизлияниях, перинатальной асфиксии, после вакцинации, что снижает специфичность теста.

Прокальцитонин (как маркер острой фазы воспаления) активно изучают с середины 90-х годов ХХ в. Его уровень начинает повышаться уже через 4 ч после воздействия бактериальных эндотоксинов, а пик приходится на 6–8 ч. Уровень остается высоким по меньшей мере в течение 24 ч (Dandona P. et al., 1994). При воспалительной реакции уровень прокальцитонина в крови возрастает в соответствии с ее интенсивностью без повышения уровня кальцитонина. Как и СРБ, прокальцитонин синтезируется в печени. Его продукция значительно возрастает под воздействием ФНО-α и ИЛ-6. Уровень прокальцитонина длительно остается высоким, коррелирует с тяжестью инфекции, несмотря на снижение уровня ФНО-α и ИЛ-6 (Shichkin V.P. et al., 2009). ССВО является реакцией не только на инфекцию, но и на другие повреждающие факторы. А. Lapillonne и соавторы (1998) описывают повышение уровня прокальцитонина у неинфицированных детей при перинатальной асфиксии, внутричерепных кровоизлияниях. Не будучи специфическим маркером септического процесса он, в то же время, весьма информативно отражает выраженность мультисистемной дисфункции (Wilkinson J.D. et al., 1987).

В последние десятилетия предметом активного изучения являются цитокины. Они представляют собой группу протеинов или гликопротеинов, секретируемых лимфоцитами, макрофагами и различными другими клетками. Цитокины играют роль медиаторов системного воспалительного и иммунного ответов, выполняя функции мессенджеров между участвующими в процессе клетками. Иногда используют термины «лимфокины» или «монокины», отражающие природу клетокпродуцентов, но всех их объединяет общее название — цитокины. На сегодняшний день в числе наиболее перспективных (информативных) маркеров воспалительной реакции рассматривают ИЛ-6 и -8, ФНО-α, лейкоцитарные поверхностные антигены CD11b, CD64 (Ng P.C., 2004).

ФНО-α является важным медиатором, играющим роль в патогенезе сепсиса и септического шока. В процессе воспалительного ответа он появляется одним из первых, но его концентрация в крови быстро снижается из-за связывания с рецепторами и элиминации из кровотока. Чувствительность его тестов находится в пределах 73– 88%, специфичность варьирует от 43 до 94%. При уровне ФНО-α в плазме крови ≥7,5 пг/мл (если время забора анализа совпало с его пиковой концентрацией) диагностическая чувствительность теста достигает 100%, а специфичность — 96,6%. При этом диагностическая ценность ФНО-α превышает таковую ИЛ-8, -6 и СРБ (Silveira R.C., Procianoy R.S., 1999).

Большой проблемой обследования новорожденных, особенно недоношенных, с недостаточной массой тела при рождении, является малый объем циркулирующей крови. Забор крови для анализов провоцирует анемизацию. При гемотрансфузии с целью коррекции анемического синдрома ребенку переливают кровь взрослых доноров, содержащую гемоглобин А. Препаратов фетального гемоглобина нет. В итоге провоцируется резкое увеличение высвобождения кислорода в тканях. Тканевая гипероксия ведет к оксидативному стрессу, играющему ключевую роль в развитии ретинопатии недоношенных, участвующему в патогенезе бронхолегочной дисплазии и других заболеваний.

Перспективной альтернативой диагностики ССВО у новорожденных является определение маркеров воспаления и их рецепторов в моче. Этому способствует особенность функции почек новорожденного, заключающаяся в относительно стабильном (пусть и сниженном) уровне гломерулярной фильтрации и крайне низкая концентрационная способность. Эти особенности определяют устойчивую корреляцию между концентрациями экскретируемых веществ в плазме крови и в моче.

Короткий период нахождения в кровотоке ФНО-α ограничивает его диагностическую ценность, но эту проблему можно обойти. При связывании ФНО-α с рецепторами происходит феномен шиддинга протеиновых эктодоменов, заключающийся в протеолитическом отщеплении от рецептора специфических мелких белковых молекул. Эти растворимые рецепторы долго присутствуют в циркуляции и выделяются в различные биологические жидкости (слезную, спинномозговую, бронхиальный секрет), в том числе и мочу. Там их можно определить количественным способом и оценить выраженность ССВО.

Цель исследования — установить диагностическую ценность определения растворимого рецептора ФНО-αр55 в моче недоношенных новорожденных для оценки выраженности ССВО и прогнозирования течения неонатального периода.

Объект и методы исследования

Нами проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 68 новорожденных, 16 из которых были здоровыми доношенными. Неонатальный период у них протекал без осложнений. Эти дети составили контрольную группу. 52 ребенка родились недоношенными в срок гестации 29–33 нед. Мочу для лабораторного исследования забирали в 1-е сутки жизни с помощью мочеприемника или путем катетеризации мочевого пузыря.

Определение концентрации цитокинов в образцах мочи новорожденных проводили с помощью иммуноферментного анализа («сэндвич»метод) на основе моноклональных антител по методикам, разработанным ранее в лаборатории клеточной и молекулярной иммунологии ГУ «Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии» (Минск) под руководством доктора медицинских наук Н.Н. Войтенка (Shichkin V.P. et al., 2009).

Моноклональные антитела В5, специфичные к растворимому рецептору ФНО-αр55, сорбировали на твердой фазе в концентрации 5 мкг/мл в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,6, в течение 12– 18 ч при 40 °С. В лунки вносили двукратные разведения растворимого р55 в качестве стандарта и разведения образцов биологических жидкостей в 10 mМ фосфатно-солевом буфере, рН 7,4, содержащем 0,05% Твин-20 (ФСБ-Т) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), и инкубировали при 18–20 °С в течение 50 мин, встряхивая. Биотинилированные моноклональные антитела А11, специфичные к растворимому рецептору ФНО-αр55, а затем и конъюгат стрептавидинполипероксидазы хрена («Zymed») в ФСБ-Т-БСА вносили и инкубировали в течение 30–40 мин аналогично предыдущему этапу. После каждого этапа инкубации планшеты промывали 3 раза в 10 mМ ФСБ-Т. Ферментативную активность пероксидазы измеряли в присутствии тетраметилбензидина при длине волны 450 нм.

В исследование не включали детей с гемолитической болезнью новорожденного.

Результаты и их обсуждение

В группе здоровых доношенных детей колебания концентрации растворимого рецептора р55 в моче были в диапазоне 0,7–28,9 нг/мл при медиане (Ме) 14,0 нг/мл. Учитывая то, что у здоровых детей максимальный уровень р55 в моче составил 28,9 нг/мл, это значение было принято за диагностически значимый уровень, с которым сравнивали аналогичные показатели у недоношенных детей.

В зависимости от определенного уровня р55 в моче все недоношенные были разделены на две группы. 1-ю группу составили 20 детей, уровень р55 в моче которых был <28,9 нг/мл (1,9–26,8 нг/мл, Ме — 15,2). 2-ю группу составили 32 недоношенных с уровнем р55 ≥29 нг/мл (34,1–118,7 нг/мл, Ме — 79,0). Масса тела при рождении, гестационный возраст, оценка по шкале Апгар на 1-й минуте жизни не имели статистически достоверных различий при межгрупповом сравнении. Никто из обследованных детей не получал антенатальную профилактику респираторного дистресссиндрома глюкокортикостероидами. Для оценки клинических проявлений мультисистемной дисфункции нами учитывалась длительность респираторной поддержки методами искусственной вентиляции легких (ИВЛ) и спонтанного дыхания под постоянным положительным давлением (Continuous Positive Airway Pressure — СРАР), инфузионной терапии и антибиотикотерапии. Нами также проанализирована длительность фототерапии с целью лечения гипербилирубинемии, с учетом того, что билирубиновый обмен у новорожденных легко страдает под воздействием инфекционного эндотоксикоза, гемодинамических расстройств, гипоксических повреждений тканей и других составляющих мультисистемной дисфункции. Полученные результаты представлены в таблице.

Таблица. Зависимость продолжительности лечения недоношенных от уровня растворимого рецептора ФНО-αр55 в моче

Как следует из приведенных результатов, уровень р55 в моче достаточно информативно отражает выраженность расстройств основных витальных функций и позволяет прогнозировать особенности течения периода постнатальной адаптации у недоношенных новорожденных.

Выводы

Определение уровня растворимого рецептора ФНО-αр55 в моче новорожденных является высокоинформативным и неинвазивным тестом, отражающим наличие и выраженность системного воспалительного ответа. Определение этого маркера позволяет прогнозировать особенности течения постнатального периода у недоношенных, тяжесть и длительность манифестации мультисистемной дисфункции. Дети с повышенным уровнем р55 (≥29 нг/мл) требуют проведения статистически достоверно более длительной ИВЛ, респираторной поддержки методом СРАР, а также более длительных курсов инфузионной и антибактериальной терапии. Для этих новорожденных характерны более длительные расстройства билирубинового обмена, вынуждающие проводить продолжительные курсы фототерапии.

Литература

• American College of Chest Physicians, Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (1992) Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit. Care Med., 20(6): 864–874.
• Bone R.C., Balk R.A., Cerra F.B. et al. (1992) Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine. Chest, 101(6): 1644–1655.
• Cengiz P. (2006) Pediatric multiple organ dysfunction syndrome. In: B.P. Furhman, J.J. Zimmerman (Eds.) Pediatric critical care. Mosby Elsevier, Philadelphia, 1494–1508.
• Dandona P., Nix D., Wilson M.F. et al. (1994) Procalcitonin increase after endotoxin injection in normal subjects. J. Clin. Endocrinol. Metab., 79(6): 1605–1608.
• Dellinger R.P., Carlet J.M., Masur H. et al. (2004) Surviving Sepsis Campaign guidelines for management of severe sepsis and septic shock. Crit. Care Med., 32(3): 858–873.
• Lapillonne A., Basson E., Monneret G. et al. (1998) Lack of specificity of procalcitonin for sepsis diagnosis in premature infants. Lancet, 351(9110): 1211–1212.
• Ng P.C. (2004) Diagnostic markers of infection in neonates. Arch. Dis. Child Fetal. Neonatal., 89(3): 229–235.
• Shichkin V.P., Lon A.D., Yugrinova L.G. et al. (2009) TNF receptor p55 and IL-8(72) and IL-8(77) isoforms: blood and urine levels in breast cancer patients. J. Immunotoxicol., 6(4): 235–242.
• Silveira R.C., Procianoy R.S. (1999) Evaluation of interleukin-6, tumour necrosis factor-alpha and interleukin-1beta for early diagnosis of neonatal sepsis. Acta Paediatr., 88(6): 647–650.
• van Rossum A.M., Wulkan R.W., Oudesluys-Murphy A.M. (2004) Procalcitonin as an early marker of infection in neonates and children. Lancet Infect. Dis., 4(10): 620–630.
• Wilkinson J.D., Pollack M.M., Glass N.L. et al. (1987) Mortality associated with multiple organ system failure and sepsis in pediatric intensive care unit. J. Pediatr., 111(3): 324–328.