Изучение клеточного и гуморального иммунитета при невынашивании беременности на фоне энтеровирусной инфекции

С.В. Мальцев, В.П. Лакатош, Е.М. Корнилина, Л.М. Лазаренко, О.Ю. Костенко, В.В. Газий Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца

В представленном материале отражены основные изменения клеточного и гуморального иммунитета у жен­щин с невынашиванием беременности на фоне энтеровирусной инфекции. Проведено сравнение иммуноло­гических изменений у женщин с невынашиванием беременности на фоне энтеровирусной инфекции и без нее.

Ключевые слова: энтеровирусное инфицирование, клеточный и гуморальный иммунитет. Невынашивание беременности продолжает оста­ваться чрезвычайно важной и значимой проблемой в современном акушерстве и гинекологии. Частота не­вынашивания в Украине, по данным МЗ, за 2006 г. составляла 15-23% от всех исходов беременности. В настоящее время пересмотрено отношение к раз­личным формам невынашивания беременности. На сегодняшний день под преждевременными родами понимают роды со спонтанным началом, прогресси­рованием родовой деятельности и рождением плода с массой более 500 г в срок беременности с 22 по 37 нед гестации (согласно приказу №676 МЗ Украины от 31.12.2004). Анализ этиологической структуры невынашивания беременности позволяет предположительно распре­делить влияние основных причин в зависимости от срока беременности. Прерывание беременности до 5-6 нед чаще всего обусловлено генетическими и иммунологическими нарушениямианомалиями кариотипа эмбриона, степенью совместимости антиге­нов родителей по системе гистосовместимости (HLA), индивидуальным повышением в организме матери уровней NK и провоспалительных цитокинов. Абортивный исход в сроке 7-9 нед в основном свя­зан с гормональными нарушениямис недостаточно­стью лютеиновой фазы любого генеза, гиперандрогенией (надпочечниковой, яичниковой, смешанной), сенсибилизацией к гормонам (появление антител к ХГ, прогестерону). При прерывании беременности в 10-16 нед на пер­вый план выступают такие причины, как различные аутоиммунные нарушения, в том числе антифосфолипидный синдром (АФС), а также тромбофилические нарушения иного генеза (наследственная тромбофилия, избыток гомоцистеина и др.). Инфекция, истмико-цервикальная недостаточность, тромбофилические нарушения, приводящие к развитию пла­центарной недостаточности и тяжелым осложнениям беременности (к отслойке плаценты, задержке внут­риутробного развития плода, гестозам и др.), явля­ются факторами риска невынашивания после 16 нед беременности [1, 3, 7]. Среди многообразия причин невынашивания значи­тельная роль принадлежит инфекции. Внутриутроб­ное инфицирование плода является одним из опре­деляющих факторов антенатальной, интранатальной и постнатальной его гибели и обусловливает значи­тельный процент случаев прерывания беременности как в ранние, так и в более поздние сроки. Особый интерес в этой связи вызывают вирусные инфекции. Вирусы способны проникать через плаценту, а при аутоиммунных заболеваниях, гестозах, угрозе пре­рывания беременности трансплацентарный переход вирусов осуществляется практически беспрепятст­венно. Иммуносупрессивный эффект вирусов объяс­няет их инвазию и феномен персистенции в орга­низме женщины. Тропность вирусов к тканям с высо­ким уровнем метаболизма обусловливает их мас­сивное проникновение в быстро делящиеся клетки эмбриона, которые являются идеальной средой для репликации вирусных частиц. Вирусная диссеминация не может не приводить к изменениям в иммун­ной системе, системе интерферонов, цитокиновому дисбалансу. Вирусная антигенемия и способность к гетерогонизации структур клеточных мембран очень часто является пусковым механизмом возникнове­ния аутоиммунных нарушений. Доказанная цитодеструктивная активность многих вирусов в отношении эндотелиоцитов может провоцировать гиперкоагуляционные изменения, которые характерны для хрони­ческого ДВС-синдрома. Среди всех вирусных инфекции наименее изучена этиологическая взаимосвязь энтеровирусов и невынашивания беременности [11] . Данные об изменениях клеточного и гуморального иммунитета представляют особый интерес для по­нимания патогенетического механизма невынашива­ния, особенно на фоне вирусной инфекции. В первые недели беременности популяция лимфо­цитов децидуальной ткани, особенно локализирую­щаяся в зоне будущей имплантации, представлена на 80% CD56+ NK-клетками (среди них превалируют CD56+CD16-/CD3-, большие гранулярные лимфоци­ты БГЛ), Т-лимфоцитами CD 3+ около 10% и Cd14+ (макрофагами) приблизительно 9-10%. БГЛ вырабатывают пептид трансформирующий фактор роста, который подавляет активацию и пролифера­цию цитотоксических клеток [3, 5]. На больших гра­нулярных клетках имеется два вида рецепторовKIR, контакт с которыми ведет к блокированию цито­токсических реакций, и KAR, активация которых спо­собствует запуску каскада реакций, приводящих к отторжению трофобласта [9]. HLAG-антиген, экс­прессируемый трофобластом, распознается KIRрецепторами и при этом цитотоксические реакции выключаются. Большая роль для нормального раз­вития беременности, особенно на ранних сроках, принадлежит белку TJ6, который синтезируется лимфоидной тканью децидуальной оболочки. Этот протеин, связываясь с рецепторами цитотоксических NK-клеток, вызывает их апоптоз. Прогестерониндуцированный блокирующий фактор (PIBF), синтез ко­торого катализируется эндогенным прогестероном, направляет иммунный ответ матери на эмбрион в сторону менее активных NK-клеток больших грану­лярных лимфоцитов, а через их KIR-рецепторы им­мунная реакция осуществляется по ^2-пути (по­средством регуляторных цитокинов) [12]. Поэтому чрезвычайно важным фактором, определяющим нормальное протекание беременности, считается преобладание регуляторных ^2-цитокинов. Эта группа цитокинов (ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, коло­ниестимулирующий фактор гранулоцитов и макро­фагов, лейкемия-ингибирующий фактор), секретируемых лимфоцитами CD4+ 2-го типа, стимулирует рост и дифференцировку клеток трофобласта на внутренний слой цитотрофобласт и наружный синцитиотрофобласт [10]. На протяжении всей беременности (с самого ее на­чала) абсолютное количество Т-лимфоцитов (CD 3) и их основных разновидностей (CD 4 и CD 8) умень­шается, но это не свидетельствует о развитии имму­нодефицита во время беременности. Супрессия специфического звена иммунного ответа в гравидарный период компенсируется активацией системы ес­тественного иммунитета. Мобилизация системы не­специфической резистентности (естественного им­мунитета) характеризуется увеличением количества моноцитов и гранулоцитов, что и обеспечивает за­щиту организма беременной от большинства бакте­риальных инфекций. Однако этого бывает недоста­точно для элиминации внутриклеточных возбудите­лей, особенно вирусов. Поэтому вирусные инфекции могут протекать тяжелее, чем вне беременности. С другой стороны, гиперактивация системы естествен­ного иммунитета во время беременности может по­служить пусковым механизмом для гиперпродукции провоспалительных цитокинов, которые напрямую или опосредовано могут приводить к абортивному исходу беременности [3, 7, 9, 13]. Учитывая вышесказанное, очевидно, что в основе невынашивания беременности лежат иммунные ре­акции на гуморальном и клеточном уровне. Поэтому проведение иммунологических исследований обяза­тельно для женщин с невынашиванием, ассоцииро­ванным с энтеровирусной инфекцией. Цель работы изучить состояние клеточного и гу­морального звеньев иммунитета у женщин с невы­нашиванием беременности на фоне энтеровирусной инфекции и при ее отсутствии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В условиях КГКБ № 18 были обследованы 59 жен­щин с невынашиванием беременности. Пациентки были разделены на 2 группы1-я группа 29 жен­щин с невынашиванием беременности и диагности­рованной энтеровирусной инфекцией, 2-я группа 30 пациенток, у которых энтеровирусы не были вы­явлены. Контрольную группу составили 30 здоровых женщин после искусственного прерывания беремен­ности. В обеих группах самопроизвольное прерыва­ние беременности происходило в сроки 10-20 нед. Детекцию энтеровирусов в 1-й группе производили в осадке мочи при помощи полимеразной цепной ре­акции (ПЦР). Для проведения данного исследования использовали коммерческие тест-системы АмплиСенс 100Р (Россия), выделение РНК вирусов осуще­ствляли при помощи набора для выделения РНК РИБО-сорб (Россия). Материалом для иммунологических исследований была периферическая кровь. Фагоцитарную актив­ность моноцитов (Мц) и нейтрофильных гранулоци­тов (Нф) определяли в тесте с частицами латекса (1,5 мкм) по методу Т.И. Ивчик [4], их бактерицидную активность в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ) с определением функционального резерва, который рассчитывали по разнице спонтанного и стимулированного пирогеналом (1,25 мкг/мл) НСТтестов [13]. Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли по методу Digeon[8], уровень сы­вороточных иммуноглобулинов A, M, Gпо Mancini[10]. Фенотипирование лимфоцитов с антигенными поверхностными маркерами CD3 (Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы), CD8 (Т-супрессоры/ цитотоксические лимфоциты), CD16 (натуральные киллеры), CD19 (В-лимфоциты), CD25 (рецептор для ИЛ-2 на активированных клетках), CD3+/HLA-DR+ (активиро­ванные Т-лимфоциты), CD3-/HLA-DR+ (активирован­ные В-лимфоциты) проводили на приборе FACSCAN (BectonDickinson, (США) с использованием монокло­нальных антител фирмы «Caltag» (США) согласно инструкции производителя. Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами вариационной статистики с применением программы Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении фенотипа мононуклеарных клеток пе­риферической крови было выявлено повышение экспрессии поверхностных антигенов у пациенток 1-й группы (верифицирована энтеровирусная инфекция) по сравнению с аналогичными показателями у жен­щин контрольной группыувеличение относительно­го и абсолютного количества Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+) и природных киллеров (CD16+) (табл. 1). Относительное количество Т-супрессоров/ цитотоксических клеток у женщин 1 -й группы было снижено по сравнению с контролем на 22%. Степень активации Ти В-лимфоцитов определяли по коли­честву клеток с HLA-DR-рецепторами. Было уста­новлено уменьшение их экспрессии на Тлимфоцитах и незначительное снижение на Влимфоцитах. Наиболее существенное снижение от­носительного количества CD3+/HLA-DR+ клеток по сравнению с контрольными показателями наблюда­лось у пациенток 1 -й группы. У женщин 1-й группы было увеличено (на 52,9% по сравнению с нормой) количество лимфоцитов с ак­тивационным маркером CD25 рецептором для ИЛ-2,   который является необходимым ростовым факто­ром для различных субпопуляций Т-клеток. Связы­вание ИЛ-2 с рецепторами активированных Тлимфоцитов индуцирует их пролиферацию и спо­собность к продукции цитокинов. Таким образом, существенное увеличение количест­ва Ой25+-клеток свидетельствует об активации лимфоцитов, а связывание с ИЛ-2 способствует дальнейшей активации NК-клеток и макрофагов. Возрастание количества клеток с антигенами CD3, Ой4, CD16 в обеих группах наблюдения, но в боль­шей степени у пациенток с диагностированной энтеровирусной инфекцией свидетельствует о гиперак­тивации иммунитета при дополнительном бактери­альном или вирусном воздействии. Наибольшее снижение количества CD8+-лимфоцитов у пациенток 1-й группы приводило к более существенному уве­личению иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+. Анализ функциональной активности фагоцитов у па­циенток 1-й группы выявил значительное снижение фагоцитарной способности как моноцитов, так и нейтрофилов, а также уменьшение кислородзависимого метаболизма моноцитов и мобилизацию фермента­тивно-метаболической активности нейтрофилов, что подтверждает наличие воспалительного процесса, а также цитотоксическое и цитопатическое действие вирусов в отношении фагоцитов и как результат угнетение их фагоцитарной активности, а как след­ствие прогрессирование нарушений клеточной кооперации в индукции полноценного и эффективно­го иммунного ответа. При изучении гуморального звена иммунитета выяв­лены следующие особенностиу женщин 1-й группы отмечено возрастание уровня ЦИК в сыворотке кро­ви по сравнению с контролем на 18,8%, а у пациен­ток 2-й группы на 12,6% (табл. 3). При исследова­нии содержания иммуноглобулинов (А, М, G) выяв­лено следующееуровень IgG существенно не отли­чался от нормы у женщин обеих групп; содержание сывороточного 1дА было значительно снижено у женщин и 1-й, и 2-й группы. Уровень 1дМ достоверно превышал контрольный показатель (на 62,7% и 51,2% соответственно у женщин 1-й и 2-й групп). Таким образом, увеличение уровня ЦИК, IgG и 1дМ в сыворотке крови у пациенток с невынашиванием свидетельствует о развитии патологического воспа­лительного процесса, а снижение уровня сывороточ­ного 1дА, особенно у женщин 1-й группы, может спо­собствовать уменьшению преципитации и агглюти­нации большинства вирусов, которые попадают в организм женщины или персистируют в нем.

Примечание: * достоверные отличия по сравнению с контролем (Р < 0,05).

4

Примечание: * достоверные отличия по сравнению с контролем (р<0,05); ^л достоверные отличия по сравнению с женщинами 2-     й группы (р < 0,05).

    ВЫВОДЫ

1. Изучение клеточного и гуморального звеньев иммунитета у женщин с невынашиванием бере­менности позволило выявить значительные от­клонения от контроля у женщин с невынашива­нием беременности и с диагностированной энтеровирусной инфекцией отмечена более выра­женная активация лейкоцитов крови, что выра­жалось усилением активации Т-лимфоцитов, Тхелперов, натуральных киллеров; кроме того, увеличение CD25+-клеток может приводить к стимуляции NK-клеток и макрофагов, что будет служить пусковым механизмом для цитокиновой агрессии.
2. Выявленное снижение фагоцитарной активности моноцитов, нейтрофильных гранулоцитов у па­циенток с невынашиванием беременности, в большей степени при диагностированной энтеровирусной инфекции, можно считать неблаго­приятным условием, так как не будет способст­вовать эффективной противовирусной защите.
3. Изменения со стороны гуморального иммунитета могут приводить, с одной стороны, к формиро­ванию патологического воспалительного про­цесса, с другой к снижению вируснейтрализирующей способности иммунной системы.
4. Указанные расстройства со стороны клеточного и гуморального иммунитета, выявленные пре­имущественно у женщин с самопроизвольными выкидышами на фоне энтеровирусной инфек­ции, подтверждают участие иммунной системы в невынашивании, предполагают этиологическую связь энтеровирусов в возникновении этих про­цессов.

Все вышеуказанное является основанием для даль­нейшего изучения особенностей иммунологического реагирования (системы интерферона, уровня цитокинов) у женщин с невынашиванием беременности при энтеровирусной инфекции.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Бикбулатов Р.М., Фабер Н.А., Босгажан Л.Г. Вирусоносительство у беременных женщин // Воп­росы охраны материнства и детства. 1982. №
2. С. 51-53.
3. Володин Н.Н., Румянцева А.Г., Владимирская Е.Б., Дегтярева М.В. Цитокины и преждевремен­ные роды // Педиатрия. 2001. № 4. С. 72­77.
4. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллер­гология. М.: ООО «Мед. информац. аг-во», 2003. 604 с.
5. Ивчик Т.В. Клиническая оценка диагностического и прогностического значения функциональной активности альвеолярных макрофагов у больных хроническим бронхитом / Клиника и лечение хронического бронхита. Л., 1980. С. 40-44.
6. Пальцев М.А. Цитокины и их роль в межклеточ­ных взаимодействиях // Архив патологии. 1996. —       Т. 58, № 6. С. 3-7.
7. Сельков С.А. Иммунологические аспекты невы­нашивания беременности: Автореф. дис. … д_ра мед. наук. СПб, 1996. 42 с.5
8. Сидельникова В.М. Привычная потеря беремен­ности. М.: Триада-Х., 2000. 304 с.
9. Digeon M., Caser M., Riza J. Detection of immune complexes in human sera by simplified assays with polyethylene glycol // Immunol. Method. 1977. 226. P. 497-509.
10. Jonson P.M., Vince G.S. Cytokine balance and reg­ulation in human uteroplacental tissue // The 3 con­gress of Europeansociety for reproductive and de­velopmental immunology, 19-21 sept. 2000. Poz­nan, Poland, 2000. P. 45.
11. Manchini G., Carbonare A.O., Haremans J.E. Im­munochemical quantitation of antigens by single radial diffusion // Immunochemistry. 1965. № 2.-      P. 235-237.
12. Marz C.M., Vigano A. et al. Characterization of type 1 and type 2 cytokine production profile in physi­ologic and pathologic human pregnаncy // Clin. Exp. Immunol. 1996. 106. № 1. P. 127.
13. Opal S.M., DePalo V.A. Anti_inflammatory cytokines // Chest. 2000. V. 117. P. 1162-1172.
14. Park B., Fikring S., Smithwick B. Infection and nitrobluetetrazolium reduction by neutrophils // The Lancet. 1988. 2. P. 532-534.
15. Vianna L., Khamashta M., Ordi_Ros J. Comparison of the primary and secondary antiphospholipid syn­drome: A European Multicenter Study of 114 pa­tients // Am. J. Med. 1994. 96. P. 3-9.
16. Wilson W.A. Antiphospholipid syndrome // Rheu­matic Disease Clinics of North America. 2001. 27. P. 3.
17. Witkin S.S., Ledger W. Antibodies to chlamidia tra­chomatis in sera of women with recurrent spontane­ous abortions // AM. J. Obstet. Gynecol. 1992. 167. P. 135.
18. Zdravcovich M., Knudsen H.J., Liu X. High interfe­ron alfa levels in placenta, maternal and cord blood suggest a protective effect against intrauterine herpes virus infection // J. Med. Viral. 1997. 51, P. 210.